产品货号:
WH0155
中文名称:
高通量高纯质粒提取试剂盒(1~1.3mL,微板吸附法)
英文名称:
96wells Mini Plasmid Extraction Kit(1-1.3mL)
产品规格:
4×96T|24×96T
发货周期:
1~3天
产品价格:
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本试剂盒通过96孔吸附板特异性地结合溶液中的质粒DNA。96孔吸附板中采用的硅基质材料为本公司新型材料,能够高效、专一的吸附质粒DNA,可去除蛋白及其他杂质,从而保证提取质粒的纯度。无需使用酚、氯仿等有毒有害试剂。
本试剂盒每孔可处理1.3mL高拷贝质粒菌液,从中可快速提取多至5~10μg质粒DNA(产量与质粒拷贝数、细菌状态等因素有关)。提取的质粒DNA可用于各种分子生物学实验,如酶切、测序、文库筛选、连接和转化等。
- 提取速度快。
- 配备了独特的IndRed试剂,可以清晰辨明抽提过程中样本的裂解程度,确保得到高效率、高纯度的质粒DNA。
- 纯度高:可直接用于下游实验。
- 可用于高通量自动化核酸提取工作站。
组分 | 4×96T | 24×96T |
平衡液BL | 240mL | 3×500mL |
溶液P1 | 125mL | 3×240mL |
溶液P2 | 125mL | 3×240mL |
溶液P3 | 160mL | 4×250mL |
去蛋白液PD | 240mL | 3×500mL |
漂洗液PW | 3×50mL | 2×500mL |
洗脱缓冲液TB | 60mL | 240mL |
IndRed | 700μL | 4×1mL |
RNase A (10mg/mL) | 1.25mL | 6×1.25mL |
半裙边96孔吸附板CP3 | 4个 | 24个 |
半裙边96孔过滤板) | 4个 | 24个 |
96孔深孔板 | 16个 | 96个 |
250mL试剂瓶 | - | 1个 |
封口膜 | 16张 | 96张 |
透气膜 | 5张 | 25张 |
该试剂盒置于室温(15~25℃)干燥条件下,可保存15个月,若溶液产生沉淀,使用前应可在30℃水浴中预热10min以溶解沉淀。溶液P1加入RNase A后,应置于2~8℃保存,可稳定保存6个月。单独包装的RNase A可在室温保存15个月。
- 96孔板细菌培养方法:将含相应抗生素的培养基加入96孔深孔板中,每孔添加1.0~1.3mL培养基且挑取单克隆摇菌,加盖透气膜封板以防污染,在220~280rpm 37℃条件下培养20~24h。
- 溶液P1使用前先加入RNase A (请分批配制,每125mL P1加入1.25mL RNase A (10mg/mL),可用于4板提取反应),混匀,置于2~8℃保存。
- 每次使用前取50mL漂洗液PW并加入200mL无水乙醇摇匀后使用。
- 使用前先检查平衡液BL、溶液P2和P3是否出现浑浊,如有混浊现象,可置于37℃水浴中加热几分钟,即可恢复澄清。溶液P2和P3使用后应立即盖紧盖子。
- 所有离心步骤均为室温下进行离心。
- 提取的质粒量与细菌的培养浓度、宿主菌、质粒拷贝数等因素有关。
- 实验前使用平衡液处理吸附板,可以充分激活硅基质膜,提高得率。
- 用平衡液处理过的吸附板最好当天使用,放置时间过长会影响提取效果。
IndRed使用方法:
IndRed是一种颜色指示剂,用以指示整个操作的正确性,不影响任何下游实验且对人体无害。为可选试剂,客户根据需求选择是否添加。
若选择添加,则在使用之前按IndRed:P1=1:200进行添加,颠倒混匀至完全匀相。在使用时添加IndRed的P1溶液为红色;添加P2之后红色完全变为紫色说明充分裂解;再添加P3溶液之后匀相状态为黄色说明中和复性充分。
用户可以选择离心法或负压法。
一、离心法
- 平衡96孔吸附板:将96孔吸附板CP3和96孔深孔板叠放在一起,向吸附板中每孔加入500μL的平衡液BL,3600rpm(~2130×g)离心3min,倒掉深孔板中的废液,将吸附板重新放在深孔板上。(请使用当天处理过的吸附板)。
- 集菌步骤:向一个新的96孔深孔板中添加1.0~1.3mL摇好的菌液(或者取摇好菌液的96孔板),加盖封口膜,3600rpm(~2130×g)离心10min收集菌体,倒掉培养基,倒扣于吸水纸上除去残留的培养基(如果菌体浓度较低,可以重复集菌一次)。
- 向每孔收集好的细菌培养物中加入250μL溶液P1 (请先检查是否已加入RNase A),加盖封口膜,使用漩涡混合器彻底悬浮菌体。
注意:若溶液P1添加IndRed试剂,则此时为红色。 - 揭去封口膜,向96孔深孔板中每孔加入250μL溶液P2,加盖新的封口膜,温和地上下翻转6~8次使菌体充分裂解,瞬时离心使封口膜上的水珠落回板中。
注意:温和地混合,不要剧烈震荡,以免打断基因组DNA,若使用IndRed试剂,完全混匀时颜色为紫色,若裂解不充分会有部分红色残留。混匀后菌液应变得清亮粘稠,所用时间不应超过5min,以免质粒受到破坏。 - 揭去封口膜,向96孔深孔板中每孔加入350μL溶液P3,加盖新的封口膜,立即温和地上下翻转6~8次使其充分混匀。
注意:溶液P3加入后应立即混合,避免产生局部沉淀。若使用了IndRed试剂,完全混匀应从紫色变为黄色。 - 将96孔过滤板和一个新的96孔深孔板叠放在一起,取750μL上步得到的裂解溶液转入对应的96孔过滤板中(过滤板的承载量为750μL),3600rpm(~2130×g)离心5min。
- 将过滤液全部转入第1步平衡好的96孔吸附板CP3中(96孔吸附板CP3叠放在收集废液的96孔深孔板上),3600rpm(~2130×g)离心5min,倒掉深孔板中的废液,将吸附板重新放在深孔板上。
- 可选步骤:向吸附板CP3每孔中加入500μL去蛋白液PD,3600rpm(~2130×g)离心5min,倒掉深孔板中的废液,将吸附板重新放在深孔板上。
注意:如果宿主菌是end A+宿主菌(TG1,BL21,HB101,JM系列等),这些宿主菌含有大量的核酸酶,易降解质粒DNA,强烈推荐采用此步。
如果宿主菌是end A-宿主菌(DH5α,TOP10等),这步可省略。 - 向96孔吸附板CP3每孔中加入700μL漂洗液PW (请先检查是否已加入无水乙醇),3600rpm(~2130×g)离心5min,倒掉收集板中的废液。
- 重复操作步骤9。
- 将96孔吸附板CP3叠放在96孔深孔板上,置于3600rpm(~2130×g)离心10min,目的是将吸附板中残余的漂洗液去除。
注意:漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应(酶切、PCR等)实验。 - 将吸附板CP3放入新的96孔深孔板中,使用排枪向96孔CP3吸附膜的中间部位悬空滴加80~100μL洗脱缓冲液TB或ddH2O(pH≥7.5),室温放置5~6min,3600rpm(~2130×g)离心10min将质粒溶液收集到收集板中。
注意:通常100μL的洗脱液在洗脱后能回收到平均55μL的DNA产物。为增加核酸的得率,可以适当增加洗脱液的体积(比如采用120μL洗脱液进行洗脱)。此外,洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若用ddH2O做洗脱液应保证其pH值在7.0~8.5范围内,pH值低于7.0会降低洗脱效率;且DNA产物应保存在-20℃,以防DNA降解。
二、负压法
- 平衡96孔吸附板CP3:将96孔吸附板CP3放入负压装置中,每孔加入500μL的平衡液BL,开启并调节负压,抽掉吸附板中的溶液。(请使用当天处理过的吸附板)
- 以下步骤同离心法中的第2~5步骤操作方法。
- 接离心法第5步骤之后,将96孔过滤板和第1步平衡好的96孔吸附板CP3叠放后置于负压装备上,过滤板每一个孔需对应吸附板的每一个孔。
注意:此步操作应按照各种品牌的负压装置要求进行操作。 - 取上步得到的裂解溶液750μL左右,转入对应的96孔过滤板中(过滤板的承载量为750μL),调节负压抽干溶液。
- 可选步骤:向吸附板CP3每孔中加入500μL去蛋白液PD,调节负压抽干溶液。
注意:如果宿主菌是end A+宿主菌(TG1,BL21,HB101,JM系列等),这些宿主菌含有大量的核酸酶,易降解质粒DNA,强烈推荐采用此步。如果宿主菌是end A-宿主菌(DH5α,TOP10等),这步可省略。 - 向96孔吸附板CP3每孔中加700μL漂洗液PW,调节负压抽干溶液。
- 重复步骤6。
- 使用最大负压继续抽10min,以彻底抽干吸附材料中残余的漂洗液。若柱尾仍然含有水珠用吸水纸吸干即可。
- 将吸附板CP3放入一个新的96孔深孔板中,使用排枪向96孔CP3吸附膜的中间部位悬空滴加80~100μL洗脱缓冲液TB或ddH20(pH≥7.5),室温放置5~6min,3600rpm(~2130×g)离心10min将质粒溶液收集到深孔板中。
DNA浓度及纯度检测
- DNA可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。
- DNA应在OD260处有显著吸收峰,OD260值为1相当于大约双链DNA 50μg/mL、单链DNA 40μg/mL。
OD260/OD280比值应为1.7~1.9。
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